fa طراحی کنترل داخلی واکنش زنجیره‌ای پلیمراز باکتری مایکوپلاسما به روش رقابتی پزشکی Medicine پژوهشی Original <p dir="rtl"><strong>چکیده</strong></p> <p dir="rtl"><strong>سابقه و هدف:</strong> مایکوپلاسماها مهمترین و جدی‌ترین آلوده‌کننده‌های فرآورده‌های بیولوژیک تولیدی در کشت‌های سلولی می‌باشند. تکنیک <span dir="ltr">PCR</span> جهت شناسایی سریع جنس مایکوپلاسما، از اولویت بالایی برخوردار است. اما یکی از معایب این روش، نداشتن کنترل داخلی است. هدف اصلی این مطالعه، استاندارد کردن تست <span dir="ltr">PCR</span> تشخیص جنس مایکوپلاسما از طریق ساخت کنترل داخلی به روش رقابتی است.</p> <p dir="rtl"><strong>مواد و روش‌ها:</strong> با استفاده از پرایمرهای ویژه<span dir="ltr">‌</span>ی هدف <span dir="ltr">16S rRNA</span>، تست <span dir="ltr">PCR</span> جهت تشخیص مولکولی جنس مایکوپلاسما بهینه شد. پرایمرهای مرکب (<span dir="ltr">Composite Primer</span>) برای کنترل داخلی با استفاده از پرایمرهای ژن کینتوپلاست انگل لیشمانیا طراحی و سپس قطعه‌ی کنترل داخلی تکثیر گردید. هر دو محصول هدف و کنترل داخلی بعد از خالص‌سازی به پلاسمید <span dir="ltr">PTZ57 R</span> اتصال و سپس در باکتری اشرشیا کلی <span dir="ltr">JM107</span> ترانسفورم و نهایتاً کلون گردید.</p> <p dir="rtl"><strong>یافته‌ها:</strong> اندازه<span dir="ltr">‌</span>ی محصول تشخیصی و کنترل داخلی به ترتیب <span dir="ltr">272bp</span> و <span dir="ltr">672bp</span> بود، که از نظر اندازه، اختلاف مطلوبی با هم داشتند. تعداد حداقل کنترل داخلی در هر واکنش، 1000 عدد تعیین شد. حساسیت تست <span dir="ltr">PCR</span> برای تشخیص جنس مایکوپلاسما، 10 باکتری به دست آمد. در تست ویژگی با عوامل مختلف، هیچ محصول ناخواسته‌ای مشاهده نشد. طیفی که در آن تکثیر کنترل داخلی مشاهده شد، بین صد تا ده میلیون باکتری بدست آمد.</p> <p dir="rtl"><strong>نتیجه‌گیری: </strong>در کنار سرعت و دقت بالای تکنیک <span dir="ltr">PCR</span>، نتایج منفی و مثبت کاذب که به دلیل وجود مهارکننده‌های واکنش <span dir="ltr">PCR</span> رخ می‌دهند، می‌تواند کارایی این روش را کاهش دهد. استفاده از یک <span dir="ltr">DNA</span> دیگر به عنوان کنترل داخلی می‌تواند این خطاها را شناسایی کند.</p> <p style="text-align: left"><strong>Abstract:</strong></p> <p style="text-align: left"><strong>Background and Aim:</strong> Mycoplasma is one of the smallest alive microorganisms, having the ability of transmitting from microbiological filters makes it to be a severe and important contaminant for cell culture, biological and biotechnological products. Using a rapid and sensitive method for diagnosing Mycoplasma&rsquo;s infection is the first priority. This method should be able to discover typical Mycoplasma&rsquo;s infection, but for meeting the standard we need to produce the internal control competitively in Mycoplasma spp PCR recognizing, which is the main aim of the project.</p> <p style="text-align: left"><strong>Materials and Methods:</strong> Using of special primers for IS6110 target, PCR test was optimized. Besides, the composite primers for IC- <em>M. spp</em> were designed then the PCR was optimized. The IC- <em>M. spp</em> which amplified in constringent condition, was ligated in pTZ57R plasmid, transformed&nbsp; in E.coli JM107 and was cloned. Specification, sensitivity of test and the number&nbsp; needed in each test. Also PCR with internal control were defermined. The number of IC, which is needed in each PCR reaction was scanned in the matter of dilution and PCR response with IC.</p> <p><strong>Results:</strong> PCR amplicon for <em>Mycoplasma spp</em> and IC- <em>M. spp</em> with special primers were 272bp and 660bp respectively, so there was a significant different between their size.</p> <p style="text-align: left"><strong>Conclusion: </strong>Despite the high speed and accuracy of PCR, false positive and negative results, which are caused because of PCR inhibitors, are the important problems of this technic that can reduce its efficiency. Using another DNA as an internal control can detect these inhibitors. Indeed, amplification of this DNA shows correct amplification and detection steps.</p> واژگان کلیدی: جنس مایکوپلاسما, کنترل داخلی تکثیری, PCR , طراحی, ساخت Keywords: Mycoplasma spp, Internal amplification control, PCR, Design, Construction 104 111 http://pajoohande.sbmu.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-1-893&slc_lang=fa&sid=1 Mohammad Hassan Shahhosseiny محمدحسن شاه حسینی 1900319475328460010338 1900319475328460010338 Yes Tamanna Nafariyeh تمنا نفریه 1900319475328460010339 1900319475328460010339 No دانشگاه آزاد اسلامی - واحد قم Elham Moslemi الهام مسلمی 1900319475328460010340 1900319475328460010340 No دانشگاه آزاد اسلامی - واحد تهران شرق Mohammad Reza Zolfaghari محمدرضا ذوالفقاری 1900319475328460010341 1900319475328460010341 No دانشگاه آزاد اسلامی- واحد قم